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一个世纪前，俄国科学家伊万·巴甫洛夫做了一个经典的实验，发现经过“铃声-食物”关联训练，狗一听到铃声即可预判食物的到来，从而提前分泌唾液。这种将中性的条件刺激（例如铃声）与惩罚/奖赏性的非条件刺激（例如食物）关联起来的学习记忆能力，被称为关联学习记忆。
巴甫洛夫敏锐地注意到，“时间”严重影响训练效果：如果铃声响起一个小时后放饭，狗不能学会两者之间的联系；只有当铃声和食物同时出现，狗才能够学会二者之间的关联。他首次观察并记录下了这一现象，在其学术著作《条件反射》中强调“时间一致性”的重要。然而巴普洛夫并不清楚其背后的生物学机理。
图片来源：123RF
此后的一百年中，科学家相继在人、海兔、果蝇、蜜蜂等不同物种的学习行为中观察到类似现象，即中性条件刺激与奖惩性非条件刺激的间隔超过一定时间，学习效果会变差。研究者把能够将两者有效关联起来的最大时间间隔称为“一致性时间窗口”，其范围从几秒钟到一分钟不等。
另一方面，临床研究发现，一些神经发育不良、神经损伤或者神经退行性疾病患者表现出时间认知障碍，在巴甫洛夫式学习记忆测试中“一致性时间窗口”异常变短或变长。时间窗口异常缩短，会导致动物难以学会事物之间正常的关联；反之，时间窗口异常延长，会导致动物把原本不相关的事件联系在一起。
这些跨物种、跨疾病的现象描述以及相关性实验一再证明“一致性时间窗口”在关联学习记忆中的特殊角色，但有些谜题始终没有解开，如：1）时间窗口长度是否可调？2）它是否影响学习记忆后突触的可塑性变化？3）它受到什么神经环路和分子机理的调控？
2023年1月26日，北京大学/深圳湾实验室李毓龙团队在权威期刊《神经元》（Neuron）在线发表最新研究成果，为上述三个问题提供了答案，揭示了神经递质5-羟色胺如何双向调节关联学习记忆的时间窗口。这一发现对于理解神经疾病导致学习记忆障碍的机制，也有着重要的意义。
此次研究中，科学家们采用了经典的果蝇嗅觉学习记忆范式，果蝇经过“气味-电击”训练会对特定气味形成恐惧记忆。团队成员首先利用T-迷宫装置复现了这一经典实验，并测得果蝇习得这一关联的“一致性时间窗口”为16.9秒。
而当研究人员通过遗传学手段降低果蝇体内的5-羟色胺时，对应的“一致性时间窗口”缩短了；相反，通过抗抑郁药增加5-羟色胺水平时，一致性时间窗口被延长。也就是说，“一致性时间窗口”的长短并非固定不变，而是大脑中一个能够被5-羟色胺水平双向调节的动态变量。
▲果蝇形成嗅觉学习记忆的时间窗口受5-羟色胺的双向调节（图片来源：123RF）
那么，果蝇学习记忆行为的一致性时间窗口为什么会被5-羟色胺改变呢？研究人员推断，从神经生物学的本质来说，这涉及到突触可塑性层面的变化。
经典的电生理研究早已表明，嗅觉学习记忆形成过程中，在果蝇大脑的蘑菇体（嗅觉学习记忆中枢），Kenyon细胞和蘑菇体输出神经元（MBON）之间发生了突触抑制现象。而团队成员利用李毓龙实验室开发的乙酰胆碱探针，证实了与电生理研究一致的结果，在此基础上发现延长“气味-电击”的时间间隔会导致Kenyon细胞和MBON之间突触可塑性变化消失，而突触可塑性的这一“一致性时间窗口”为14.8秒，与行为学上得到的数据极为相近。更重要的是，人为降低或者升高5-羟色胺水平同样能改变该时间窗口的长短，表明5-羟色胺是通过调节突触可塑性，从而最终影响了学习行为。
研究人员们进一步分析了调控5-羟色胺的神经环路和分子机理。果蝇大脑的左右半球有且仅有一个向蘑菇体释放5-羟色胺的DPM神经元，过去由于缺乏合适的工具，无法直接观察其活性的时间和空间变化。而在此次研究中，利用实验室开发的5-羟色胺探针，研究人员发现DPM在蘑菇体不同功能区的5-羟色胺释放量并不均匀，而是呈现出空间特异性，5-羟色胺局部水平差异赋予蘑菇体功能区不同的时间窗口。
系统解析DPM的上下游神经环路还发现，蘑菇体中的Kenyon细胞释放乙酰胆碱激活DPM，而DPM释放的5-羟色胺对Kenyon细胞起到负反馈抑制作用。正是这一负反馈抑制神经环路，在突触可塑性和嗅觉学习记忆两个层面调节“一致性时间窗口”。
▲研究示意图：5-羟色胺能DPM神经元在蘑菇体中形成负反馈抑制神经环路，在突触可塑性和嗅觉学习记忆两个层面调节“一致性时间窗口”（图片来源：参考资料[1]）
研究人员指出，关于突触可塑性如何产生，经典的赫布理论（Hebb’s rule）和先前的电生理研究提出，突触前、突触后神经元同时兴奋会使突触处于能够被改变、但尚未发生改变的状态，等待第三个元素出现；第三个元素是由神经调制介导的惩罚或者奖励信号，它的出现最终决定突触可塑性变化的方向和幅度。但这一理论并不完美，因为不清楚等待时间长短由什么元素决定。此次研究通过实验表明，5-羟色胺是这一理论中被遗漏的“时间调节因子”。
这些新发现不仅为我们进一步理解人类的学习记忆行为提供洞见，也将有助于理解学习记忆障碍的病理机制，为药物干预患者的时间认知障碍提供新的见解。
北京大学生命科学学院教授/深圳湾实验室分子生理学研究所合作研究员李毓龙、深圳湾实验室分子生理学研究所博士后曾健智为共同通讯作者，曾健智博士和北京大学生命科学学院博士研究生李雪霖为共同第一作者，张任子墨、吕明月博士、王艺潘、谭柯、夏西聚、万金霞博士、张修宁、李瑜等对文章做了重要贡献。该工作得到了北京脑科学与类脑研究中心井淼团队、中科院生物物理所李岩团队（杨扬）、中科院深圳先进技术研究院储军团队（王亮）的通力合作。研究的支持来自北京大学膜生物学国家重点实验室、北大-清华生命科学联合中心、深圳湾实验室、国家自然科学基金、北京市科委、峰基金、Clement & Xinxin Foundation和中国博士后科学基金。
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参考资料：
[1] Zeng et al., Local 5-HT signaling bi-directionally regulates the coincidence time window for associative learning, Neuron (2023), https://doi.org/10.1016/j.neuron.2022.12.034
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